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产品目录 > 生物试剂与缓冲液 >>EMSA核蛋白抽提

产品简介:细胞核和细胞浆目前成为研究细胞组分的两个热点，获得高浓度的细胞核蛋白和细胞浆蛋白成为得到好的研究结果的重要实验过程。本试剂盒主要原理是在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒是本公司非放射性EMSA试剂盒（cat; SIDET001, SIDET003, SIDET004, SIDET006, SIDET007）实验成功的重要部分，经BCA测定24cm²贴壁细胞（或50ml规格培养瓶养的悬浮细胞）抽提物，核蛋白浓度约为1.6－3.0ug/ul.。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒可足够您进行50次抽提操作。使用详见使用说明书。

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包装清单：

试剂	包装	总量
5×Buffer A	1瓶	35ml/瓶
2×Buffer B	1支	1.5ml/支
Solution I（溶液I）	1支	1.75ml/支
Solution II（溶液II）	1支	1.75ml/支
Solution III（溶液III）	1支	1.5ml/支
PMSF Solution	1支	0.85ml/支
User Manual (说明书)	1份	1份/Kit

准备抽提试剂：

按照下列方法制备胞浆－核蛋白抽提液：页首

1. 制备3ml胞浆蛋白裂解液I ：
　

试剂	体积
5×Buffer	0.6ml
Solution I（溶液I）	30ul
Solution II（溶液II）	30ul
PMSF Solution	15ul
dd-H₂O	2.325ml
总体积	3.0ml

注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

2. 制备1.02ml胞浆蛋白裂解液II：

试剂	体积
Solution III（溶液III）	20ul
胞浆蛋白裂解液I	1.0ml
总体积	1.02ml

3. 制备50ul核裂解液：页首

试剂	体积
2×Buffer B	25ul
Solution I（溶液I）	0.5ul
Solution II（溶液II）	0.5ul
PMSF Solution	0.25ul
dd-H₂O	23.75ul
总体积	50ul

注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

细胞核蛋白抽提步骤：

贴壁细胞胞浆蛋白—核蛋白制备：

1. 将50ml规格的细胞培养物（细胞生长面积约24cm²）置于冰盒上低温操作。

2. 弃培养瓶中上清培养液，加3ml 预冷1×PBS于细胞培养瓶中漂洗细胞3次。

3. 取1.0ml胞浆蛋白裂解液I漂洗细胞一次，弃漂洗后的缓冲液。页首

4. 取1.0ml胞浆蛋白裂解液II于培养瓶中溶解细胞，可用1.0ml移液枪贴壁吹打细胞多次,可以在显微镜下观察细胞的裂解情况。

5. 尽量吸干净培养瓶中的裂解液，转入1.5ml离心管中，4℃，14,000 rpm 离心5min。

6. 用移液器分开上清和沉淀，上清液即为胞浆蛋白液，请于-80℃保存。

7. 取0.5ml胞浆蛋白裂解液I漂洗沉淀一次，4℃，14,000 rpm 离心5min，弃上清。

8. 取50ul 核裂解液（根据沉淀量多少可酌情增减）重悬沉淀，4℃，静置离心管30min，并间隔剧烈震动重悬沉淀。同时调离心机冷却至4℃。

9. 4℃，14,000rpm 离心 20min。

10. 取上清液（即核抽提物）于-80℃保存。

悬浮细胞与组织细胞的制备见产品使用说明书。

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